Eine umfassende Charakterisierung des mütterlichen, fetalen und neonatalen Mikrobioms unterstützt die pränatale Besiedlung des Magen-Darm-Trakts

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 4652 (2023) Diesen Artikel zitieren

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In dieser Studie wollten wir die Mikrobiome verschiedener Proben von schwangeren Frauen und ihren Neugeborenen umfassend charakterisieren und die Ähnlichkeiten und Zusammenhänge zwischen Mutter-Neugeborenen-Paaren, Probenentnahmestellen und geburtshilflichen Faktoren untersuchen. Wir haben Proben aus Vaginalausfluss und Fruchtwasser von schwangeren Frauen sowie Nabelschnurblut, Magenflüssigkeit und Mekonium von Neugeborenen gesammelt. Wir identifizierten 19.597.239 Bakteriensequenzen aus 641 Proben von 141 schwangeren Frauen und 178 Neugeborenen. Durch die Anwendung strenger Filterkriterien zur Entfernung von Verunreinigungen fanden wir Hinweise auf eine mikrobielle Besiedlung in traditionell als steril geltenden intrauterinen Umgebungen und im fetalen Magen-Darm-Trakt. Die Mikrobiomverteilung war stark nach Probenentnahmestelle und nicht nach Mutter-Neugeborenen-Paaren gruppiert. Die ausgeprägte Bakterienzusammensetzung im Mekonium, dem ersten Stuhl, den Neugeborene ausscheiden, deutet darauf hin, dass es während einer normalen Schwangerschaft zu einer mikrobiellen Besiedlung kommt. Das Mikrobiom in der Magenflüssigkeit von Neugeborenen war ähnlich, aber nicht identisch mit dem in mütterlichem Fruchtwasser, wie erwartet, da Föten in der Gebärmutter Fruchtwasser schlucken und ihr Urin unter normalen physiologischen Bedingungen in die Flüssigkeit zurückkehrt. Der Aufbau einer Mikrobiombibliothek aus verschiedenen Proben, die nur während der Schwangerschaft gebildet werden, ist entscheidend für das Verständnis der menschlichen Entwicklung und die Identifizierung von Mikrobiomveränderungen bei geburtshilflichen Komplikationen.

Das menschliche Mikrobiom birgt möglicherweise die Antwort auf viele Geheimnisse des menschlichen Körpers. Es wurde mit der Aufrechterhaltung der Homöostase im Gesundheitszustand in Verbindung gebracht und ist mit zahlreichen Krankheiten verbunden1,2. Die jüngste Forschung hat sich auf die Erforschung des Mikrobioms in weniger erforschten Populationen wie Säuglingen oder schwangeren Frauen verlagert, um seine Rolle in der menschlichen Entwicklung besser zu verstehen. Die Entwicklung des Mikrobioms beginnt wahrscheinlich in der Umgebung in der Gebärmutter und verändert sich im Laufe des Lebens, was sich kontinuierlich auf das Immunsystem und den Stoffwechsel auswirkt. Es hat sich gezeigt, dass eine Schwangerschaft die mikrobiellen Populationen im mütterlichen Körper verändert und sich möglicherweise auf die zukünftige Gesundheit von Mutter, Fötus und Neugeborenen auswirkt3. Eine Schwangerschaft ermöglicht eine vorübergehende Immuntoleranz gegenüber einem Fremdkörper, was die Umgestaltung des Mikrobioms und mögliche Anpassungen des Immunsystems und des Stoffwechsels erleichtert4. Einige Mikrobiomstudien in der Schwangerschaft haben ergeben, dass fetale Umgebungen, einschließlich Plazenta und Fruchtwasser, die traditionell als steril bezeichnet werden, mehrere charakteristische Mikrobiota enthalten, die in routinemäßig durchgeführten Kulturtechniken nicht identifiziert werden5,6. Allerdings ist die Biomasse dieser Mikrobiota gering und die Zuverlässigkeit der Sequenzierungsmethoden sowie das Kontaminationspotenzial wurden kritisiert. Der Zusammenhang zwischen diesen Mikrobiota und bestimmten geburtshilflichen Erkrankungen ist noch nicht nachgewiesen und bedarf weiterer Untersuchungen.

Die Vagina ist der am häufigsten untersuchte Ort von Bakterien im weiblichen Fortpflanzungsorgan, da sie über den Gebärmutterhals mit der Gebärmutter verbunden ist und der Haut ausgesetzt ist. Aufgrund ethischer Bedenken und Schwierigkeiten beim Zugang zu Proben kommt die Mikrobiomforschung in der Schwangerschaft jedoch nur langsam voran. Aagaard et al. fanden heraus, dass sich das vaginale Mikrobiom während der Schwangerschaft je nach Gestationsalter verändert und dass Lactobacillus-Arten eine Rolle bei der Verhinderung des pathogenen Bakterienwachstums spielen7. Genauer gesagt führt eine Schwangerschaft zu einer verminderten Diversität, einem erhöhten Anteil an Lactobacillus und einer höheren Stabilität im vaginalen Mikrobiom8,9. Einige Vaginalbakterien wurden durch intrauterine Entzündungen oder Infektionen mit Frühgeburten in Verbindung gebracht10,11,12,13,14, es gibt jedoch keine klinischen Richtlinien für die Prüfung oder Überwachung dieser Mikrobiota. Andere Stellen, die auf das Mikrobiom in der Schwangerschaft untersucht wurden, sind mütterlicherseits15, die Mundhöhle16, die Plazenta5, das Fruchtwasser17,18 und der Darm des Neugeborenen19; Bisherige Studien waren jedoch bruchstückhaft und eine systematischere Forschung ist erforderlich.

In dieser Studie haben wir das Mikrobiom im Vaginalausfluss (VD) und Fruchtwasser (AF) schwangerer Frauen sowie im Nabelschnurblut (CB), der Magenflüssigkeit (GL) und dem Mekonium (M) ihrer Neugeborenen umfassend charakterisiert. Ziel war es, die Zusammenhänge zwischen diesen Proben und verschiedenen geburtshilflichen Erkrankungen zu ermitteln.

Insgesamt wurden 141 schwangere Frauen mit geringem Risiko nacheinander aufgenommen und 178 Neugeborene wurden aus der Studienpopulation geboren, wobei es sich bei 37 Fällen um Zwillingsschwangerschaften handelte. Alle Frauen waren asiatischer Abstammung (Koreaner) und das Durchschnittsalter betrug 34 (Interquartilbereich 31–37) Jahre (Tabelle 1). Der Anteil der Nulliparität betrug etwas mehr als die Hälfte der Bevölkerung (67 %), und die mittleren Werte für Größe, Gewicht und Body-Mass-Index (BMI) betrugen 162 cm, 70 kg bzw. 27 kg/m2. Etwa 30 % wurden durch assistierte Reproduktionstechnologie (ART) gezeugt, einschließlich intrauteriner Insemination (IUI) und In-vitro-Fertilisation mit Embryotransfer (IVF-ET). Wie oben erwähnt, war etwa ein Viertel der Gesamtbevölkerung von Zwillingen schwanger, davon waren 19 % monochorial. Das mittlere Gestationsalter bei der Entbindung betrug 37,7 Wochen (Interquartilbereich 36,9–38,6), und die Frühgeburt vor der 37. Schwangerschaftswoche lag bei 26,2 % (37/141). Die Kaiserschnittrate betrug 55 % (77/141). Sieben Neugeborene hatten angeborene strukturelle Anomalien (Defekt des atrioventrikulären Septums, Fehlen des Corpus callosum im Gehirn, Achondroplasie, Lippenspalte, Polydaktylie und Syndaktylie), die sich nicht direkt auf das Überleben des Neugeborenen auswirkten. Die Häufigkeiten anderer geburtshilflicher Komplikationen oder zugrunde liegender mütterlicher Erkrankungen sind in Tabelle 1 beschrieben.

Wir identifizierten 19.597.239 Bakteriensequenzen und 22.412 einzigartige Amplikonsequenzvarianten (ASVs) aus 641 Proben, darunter zervikovaginaler Ausfluss (n = 154), Fruchtwasser (n = 40), Magenflüssigkeit (n = 100) und Nabelschnurblut (n = 125). ), Mekonium (n = 160) und Negativkontrollen (n = 62). Die ASVs wurden taxonomisch annotiert, wir fanden jedoch Hinweise auf Batch-Effekte in unseren Sequenzierungsdaten für alle Probentypen außer VD (Abb. 1 und ergänzende Abb. S1). Die Batch-Effekte wurden wahrscheinlich während des Bibliotheksaufbaus für die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) und nicht während der Sequenzierung selbst eingeführt (ergänzende Abbildung S2). Dies war jedoch zu erwarten, da unsere Proben an Leichenstellen mit Proben geringer Biomasse entnommen wurden, wodurch unsere Proben anfällig für Kontaminationen sind20. Daher haben wir damit gerechnet, viele falsch positive Ergebnisse zu finden, und haben eine Reihe von Filtern angewendet, wie in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt. Insbesondere haben wir 203 ASVs gefunden und entfernt, die statistisch als Kontaminanten bestimmt wurden, weil sie in Negativkontrollen stark verbreitet waren (Ergänzungsabbildung S4) oder weil sie in Proben mit niedriger Konzentration eine höhere Häufigkeit aufwiesen (Ergänzungsabbildungen S5 und S6).

Erkennung von Batch-Effekten in 16S-rRNA-Amplikon-Sequenzierungsdaten. Die Center-Log-Ratio-Transformation wurde verwendet, um die gefilterte ASV-Tabelle zu normalisieren, bevor eine hierarchisch gruppierte Heatmap basierend auf Korrelationskoeffizienten erstellt wurde. AF, Fruchtwasser; CB, Nabelschnurblut; GL, Magenflüssigkeit; M, Mekonium; VD, zervikovaginaler Ausfluss; NC, Negativkontrolle.

Wir haben die Alpha-Diversität der Proben durch Berechnung von Shannon-Indizes gemessen (Abb. 2A). Die Alpha-Diversität nahm in der folgenden Reihenfolge ab: GL, AF, M, CB und VD. Die Negativkontrollgruppe zeigte im Vergleich zur VD-Probe eine etwas höhere Diversität, was darauf hindeutet, dass Negativkontrollen für die 16S-Amplikonsequenzierung eine ebenso reiche Mikrobiomdiversität aufweisen können wie echte biologische Proben. Als nächstes haben wir die Beta-Diversität unserer Proben geschätzt, indem wir die gewichteten UniFrac-Abstände berechnet haben (Abb. 2B). Bei der Projektion mittels Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) waren die Proben mäßig gut nach Probenentnahmeorten getrennt.

Alpha- und Beta-Diversität des koreanischen Mikrobioms von Müttern und Neugeborenen. (A) Alpha-Diversität: Die gefilterte ASV-Tabelle wurde verdünnt, bevor der Shannon-Index für jede Probe berechnet wurde. Die VD-Gruppe wies die geringste Alpha-Diversität auf. AF, Fruchtwasser; CB, Nabelschnurblut; GL, Magenflüssigkeit; M, Mekonium; VD, zervikovaginaler Ausfluss; NC, Negativkontrolle; (B) Beta-Diversität: Die gefilterte ASV-Tabelle wurde verdünnt, bevor die Proben mit Hauptkoordinatenanalyse unter Verwendung der gewichteten UniFrac-Distanz in den 2D-Raum projiziert wurden.

Um festzustellen, ob Mütter Mikroben mit ihren Neugeborenen teilen, haben wir die durchschnittliche Anzahl der ASVs verglichen, die zwischen Mutter-Neugeborenen-Paaren und 1000 Paaren, die zufällig aus verschiedenen Familien ausgewählt wurden, geteilt werden. Wir führten einen einseitigen t-Test durch und stellten fest, dass Mutter-Neugeborene-Paare im Vergleich zu zufällig ausgewählten Paaren keine höhere Anzahl gemeinsamer ASVs aufwiesen (N = 0,7 bzw. N = 1,8; p = 1,0).

Um die Variationsquellen in der Beta-Diversität unserer Proben besser zu verstehen, haben wir die permutationelle multivariate Varianzanalyse (PERMANOVA) unter Verwendung verschiedener Faktoren, einschließlich klinischer Informationen, durchgeführt. Wie in Tabelle 2 gezeigt, erklärte die Variable „Site“ bei Einbeziehung aller Probentypen in die Analyse 17,2 % der Variation (p-Wert = 0,001) und die Variable „LibraryMonth“ 7,4 % (p-Wert =). 0,002). Dieses Ergebnis zeigt, dass die Proben trotz der in unserem Datensatz vorhandenen erheblichen Chargeneffekte immer noch gut auf der Grundlage des für ihre Körperstelle spezifischen Mikrobiommusters getrennt werden konnten. Als die Analyse auf jeden Probentyp mit Ausnahme der Proben-VD-Gruppe beschränkt wurde, erwies sich die Variable „LibraryMonth“ für alle Probentypen als signifikant. Die Erklärungskraft stieg auf einen Bereich zwischen 24,5 und 48,9 %. Diese Ergebnisse stimmen mit der Hypothese überein, dass es sich bei unseren Proben überwiegend um Proben mit geringer Biomasse handelt, die anfällig für Kontaminationen sind.

Zusätzlich wurde die Variable „DeliveryMethod“ als signifikant für die VD-Gruppe, die Variablen „PretermBirth37“ und „AntibioticsUse“ für die M-Gruppe und die Variable „Weight“ für die CB-Gruppe als signifikant zurückgegeben (Abb. 3). Wir haben die signifikanten Variablen in jeder Gruppe mithilfe von PCoA mit gewichtetem UniFrac-Abstand untersucht. In der VD-Gruppe wurden mehrere ASVs von Lactobacillus und ein ASV von Gardnerella gefunden. In der M-Gruppe zeigte Staphylococcus einen starken Zusammenhang mit Frühgeburten. Schließlich wurden die Listen der Bakterientaxa mit dem Gewicht der Neugeborenen in der CB-Gruppe verknüpft. Tabelle 3 zeigt die Analyse der Zusammensetzung von Mikrobiomen (ANCOM) für verschiedene klinische Daten, um jede statistisch signifikante Relevanz für Bakterien in mehreren Probentypen zu untersuchen.

Beta-Diversitätsergebnisse der PERMANOVA-Analyse. Die Hauptkoordinatenanalyse unter Verwendung der gewichteten UniFrac-Distanz wird für (A) die zervikovaginalen Ausflussproben, (B) und (C) die Mekoniumproben und (D) die Nabelschnurblutproben gezeigt.

Um die Hypothese zu testen, dass Proben von Zwillingen, sowohl monochorialen als auch dichorialen, eine größere Ähnlichkeit in der Mikrobiomzusammensetzung aufweisen als zufällig ausgewählte Proben, haben wir den Mittelwert des gewichteten UniFrac-Abstands zwischen Zwillingsproben und zufällig ausgewählten Proben verglichen. Genauer gesagt führten wir für jede der AF-, CB-, GL- und M-Gruppen einen Bootstrapping-Hypothesetest durch, indem wir zufällig paarweise Abstände mit 1000-maliger Ersetzung aus allen Stichproben abtasteten, um mit den Mittelwerten der abgetasteten Abstände ein 95 %-Konfidenzintervall zu erstellen. Wir lehnten die Nullhypothese ab, dass es für alle vier Probentypen keinen Unterschied zwischen den Zwillingsstichproben und zufällig ausgewählten Stichproben gab, da der mittlere paarweise Abstand für Zwillingsstichproben unter dem Konfidenzintervall lag (Abb. 4 und ergänzende Abb. S7). Als nächstes teilten wir die Zwillinge in monochoriale und dichoriale Zwillinge ein und führten wiederholte Hypothesentests durch. Wir fanden heraus, dass wir die Nullhypothese für alle vier Stichprobentypen für dichoriale Zwillinge immer noch ablehnen konnten. Bei monochorialen Zwillingen bestanden jedoch nur die CB- und M-Gruppen den Test.

Höhere Ähnlichkeit der Mikrobiomzusammensetzung in Zwillingsproben als in zufällig ausgewählten Proben. Für jeden Probentyp werden die Mittelwerte der gewichteten UniFrac-Abstände für die Zwillingsproben angezeigt. Ein 95-%-Konfidenzintervall wurde erstellt, indem 1000-mal zufällig paarweise Abstände ermittelt und aus den Stichproben ersetzt wurden.

Es wurde gezeigt, dass mehrere pathogene und kommensale vaginale Mikrobiota erhebliche Auswirkungen auf die Fortpflanzung und die allgemeine Gesundheit einer Frau haben. Um Referenzbereiche der vaginalen Mikrobiota mit bekannten klinischen Zusammenhängen bei allgemein gesunden schwangeren Frauen zu ermitteln, suchten wir nach bakteriellen Zielen, die häufig zur Beurteilung der Vaginalgesundheit in VD-Proben getestet werden. Genauer gesagt haben wir uns auf 31 bakterielle Ziele (15 Gattungen und 16 Arten) konzentriert, die mit dem „SmartJane“-Assay von uBiome Inc. getestet werden, darunter Lactobacillus, Sneathia und Gardnerella21. Von den 31 Bakterientaxa von klinischer Bedeutung wurden 12 in unseren Proben identifiziert (Abb. 5).

Relative Häufigkeit von Bakterien im Zusammenhang mit der Vaginalgesundheit. Im SmartJane-Assay von uBiome werden nur bakterielle Ziele angezeigt, die auch in den Vaginalausflussproben vorhanden sind.

Wir beobachteten eine höhere relative Häufigkeit von Lactobacillus auf Gattungsebene, aber geringere Häufigkeiten von Aerococcus, Fusobacterium, Gardnerella, Peptoniphilus, Porphyromonas und Prevotella. Die meisten unserer Patientinnen hatten keine schwerwiegenden schwangerschaftsbedingten Komplikationen. Darüber hinaus lag die Mehrzahl der Frühgeburten in der späten Frühgeburtszeit zwischen 34 + 0 Wochen und 36 + 6 Wochen. Daher erfasste der „SmartJane“-Assay nahezu kein pathogenes Mikrobiom. Das Spezifikationsniveau wurde untersucht und ist in Abb. 5 aufgeführt. Wir fanden Lactobacillus iners und Lactobacillus jensenii in den Testlisten, Lactobacillus Crispatus wurde jedoch nicht häufig im vaginalen Mikrobiom gefunden. Dies könnte einfach daran liegen, dass in der von uns verwendeten SILVA-Referenzdatenbank Lactobacillus Crispatus weggelassen wurde. Mithilfe der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) haben wir bestätigt, dass einige der ASVs aus der Gattung Lactobacillus tatsächlich Lactobacillus Crispatus waren (Daten nicht gezeigt).

Da Kontamination ein kritisches Thema in der Mikrobiomforschung ist, haben wir mehrere moderne Methoden verwendet, um das Vorhandensein von Bakterien zu bestätigen und Hinweise auf eine Kolonisierung in der Gebärmutter zu finden. Die ausgeprägte Bakterienzusammensetzung im Mekonium, dem ersten Stuhl, den Neugeborene ausscheiden, spricht dafür, dass es während einer normalen Schwangerschaft zu einer mikrobiellen Besiedlung in der intrauterinen Umgebung kommt22,23. Das Mikrobiom in der Magenflüssigkeit von Neugeborenen ähnelte dem im mütterlichen Fruchtwasser, wie erwartet, da Föten in der Gebärmutter Fruchtwasser schlucken und ihr Urin unter normalen physiologischen Bedingungen in die Flüssigkeit zurückkehrt. Allerdings war das Mikrobiom in der Magenflüssigkeit nicht genau dasselbe wie im Fruchtwasser, was auf die Existenz unbekannter Mechanismen für die Florabildung in der fetalen Mundhöhle oder im proximalen Magen-Darm-Trakt, wie der Speiseröhre, aus der intrauterinen Umgebung hinweist.

Ziel der Studie war es herauszufinden, ob Proben von verschiedenen Körperstellen schwangerer Frauen und ihrer Säuglinge ähnliche Mikrobiome aufweisen oder ob das mütterliche Mikrobiom an ihren Fötus weitergegeben wird. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich das Mikrobiom in erster Linie aufgrund des Körperkompartiments, in dem es gewonnen wurde, unterschied, und nicht aufgrund des Mutter-Fötus-Paares. Das heißt, von allen Faktoren, einschließlich verschiedener geburtshilflicher Erkrankungen, war die Probenahmestelle der wichtigste Faktor für die Bestimmung der Mikrobiomähnlichkeit.

Die größte Stärke dieser Studie ist ihre Studienpopulation, die aus reinen Asiaten bestand und allgemeine Schwangerschaften mit geringem Risiko widerspiegelte. Das mütterliche Alter lag zwischen 20 und 45 Jahren, was als typisch für das reproduktive Alter gilt. Es gab ungefähr gleich viele nullipare Frauen, Kaiserschnitte sowie männliche und weibliche Neugeborene. Abgesehen von einer kleinen Anzahl fetaler Belastungen, wie z. B. niedrige Apgar-Werte und Mekoniumfärbung, wurden Neugeborene mit extrem pathologischen Zuständen, die das Mikrobiom verändern könnten, wie z. B. schwere Frühgeburten und Behandlung auf einer Neugeborenen-Intensivstation (NICU), ausgeschlossen . Daher dürfte das in dieser Studienpopulation analysierte Mikrobiom eine typische Schwangerschaft darstellen. Es ist von entscheidender Bedeutung, eine Mikrobiombibliothek für schwangere Frauen mit geringem Risiko und ihre normalen Neugeborenen als Grundlage für den Vergleich mit pathologischen Zuständen einzurichten, um die Mikrobiomzusammensetzung während der Schwangerschaft besser zu verstehen.

Um die Mikrobiome zu identifizieren, die mit schwangerschaftsbedingten Erkrankungen wie der Entbindungsmethode verbunden sind, führten wir eine statistische Analyse der unterschiedlichen Häufigkeit durch. Trotz der Herausforderungen, die sich aus der geringen mikrobiellen Biomasse und den Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Probanden ergeben, die zu falsch positiven Ergebnissen führen können, scheinen die in Tabelle 3 aufgeführten Bakterien mit früheren Ergebnissen übereinzustimmen. Beispielsweise wurden Finegoldia und Bifidobacterium bereits früher mit einer gesünderen Schwangerschaft in Verbindung gebracht, und unsere Daten bestätigen diesen Zusammenhang24,25. Andere in der Tabelle aufgeführte Taxa weisen ebenfalls Verbindungen zu Entzündungen und Schwangerschaftskomplikationen auf, wie etwa Schwangerschaftsdiabetes mellitus, Präeklampsie und Frühgeburten. Das Vorhandensein von Campylobacter und Lachnospiraceae im Vaginalausfluss steht beispielsweise im Einklang mit früheren Untersuchungen, die zeigen, dass diese bakteriellen Infektionen zu Entzündungen und Frühgeburten führen können26,27.

Durch Querverweise mit klinischen Datenbanken ergab unsere Analyse mehrere signifikante Zusammenhänge. Erstens ist das reichliche Vorhandensein von Lactobacillus und Gardnerella im Vaginalausfluss ein bekannter Indikator für das Schwangerschaftsmikrobiom. Lactobacillus spielt während der Schwangerschaft eine schützende Rolle im mütterlichen Mikrobiom, während Gardnerella als Krankheitserreger gilt und stark mit Frühgeburten oder Schwangerschaftskomplikationen in Verbindung gebracht wird11,13,26. Das Vorhandensein von Faecalibacterium im Nabelschnurblut ist bemerkenswert, da gezeigt wurde, dass es bei Schwangerschaftsdiabetes mellitus abgereichert ist28, obwohl die Anzahl der Fälle in unserer Studienpopulation relativ gering war. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Staphylokokken einen starken Zusammenhang mit Frühgeburten im Mekonium haben. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Erkenntnissen überein, die darauf hindeuten, dass Staphylococcus-Infektionen zu einer Frühgeburt führen können29,30.

Bezüglich der Wirkung von Antibiotika analysierten wir den Zusammenhang zwischen Antibiotika-Einsatz und Mekoniumproben, die Ergebnisse zeigten jedoch aufgrund der geringen Probengröße nur einen begrenzten Zusammenhang. Wie Tormo-Badia et al. Berichten zufolge können Antibiotika das Darmmikrobiom der Nachkommen trächtiger Mäuse verändern31. Angesichts der Tatsache, dass das Vorhandensein eines „gesunden Mikrobioms“ während der Schwangerschaft als entscheidend für die Aufrechterhaltung einer normalen Schwangerschaft angesehen wird, kann man sich leicht vorstellen, welche möglichen negativen Folgen die Verabreichung von Antibiotika während der Schwangerschaft haben kann. Da Antibiotika nur an schwangere Frauen verabreicht werden, die Anzeichen einer Infektion oder Entzündung, spezifischer Krankheiten oder eines vorzeitigen Blasensprungs mit dem Risiko einer aufsteigenden Infektion auf den Fötus haben, ist es praktisch schwierig, die Wirkung von Antibiotika auf die Veränderung der Gebärmutter zu bestimmen geburtsbedingtes Mikrobiom.

Die Mekoniumproben zeigten das Vorhandensein von Mikrobiom-Taxa wie Lactobacillus, Staphylococcus und Ureaplasma, die zusammen als Vaginalflora bezeichnet werden11,32. Wir haben versucht, die Beziehung zwischen der Abgabeart und dem Mikrobiom im Mekonium zu bewerten, konnten jedoch keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Zusammensetzung oder Diversität feststellen. Laut einer Studie von Dominguez-Bello et al. gibt es je nach Art der Entbindung Unterschiede in den Bakteriengemeinschaften im Darm von Säuglingen33. Vaginal geborene Neugeborene haben ein Mikrobiom, das dem vaginalen Mikrobiom ihrer Mutter ähnelt und von Lactobacillus dominiert wird. Umgekehrt haben Säuglinge, die per Kaiserschnitt geboren wurden, ein Mikrobiom, das von Staphylococcus, Corynebacterium und Propionibacterium dominiert wird, die häufig auf der Hautoberfläche ihrer Mütter vorkommen.

Ungefähr ein Viertel der Schwangerschaften in unserer Studie waren Zwillingsschwangerschaften (37/141). Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Studie, die das Mikrobiom von neugeborenen Zwillingen untersucht. Im Allgemeinen zeigten unsere Zwillingsproben (AF, CB, GL und M) eine ähnlichere Zusammensetzung im Vergleich zu zufällig ausgewählten Proben, selbst bei dichorialen Zwillingen, die über getrennte intrauterine Kompartimente verfügen. Die einzige Ausnahme bildeten CB- und M-Proben von monochorialen Zwillingen, bei denen zufällig ausgewählte Proben eine größere Ähnlichkeit aufwiesen, was wahrscheinlich auf die geringe Stichprobengröße monochorialer Zwillinge zurückzuführen ist.

Die Erforschung der mikrobiologischen Merkmale einer Schwangerschaft ist seit vielen Jahren eine herausfordernde und kontroverse Aufgabe. Das Eindringen von Mikroben in die Schwangerschaftshöhle wie Fruchtwasser oder Plazenta kann zu schwerwiegenden geburtshilflichen Komplikationen wie Frühgeburten und schweren Neugeborenenmorbiditäten führen, die ein Leben lang bestehen bleiben können. Trotz der Bedeutung der Forschung zum Mikrobiom in der Schwangerschaft waren die Fortschritte aufgrund von ethischen und Zugänglichkeitsproblemen begrenzt. Wir haben mithilfe eines standardisierten Protokolls verschiedene Proben von schwangeren Frauen und ihren Neugeborenen gesammelt und eine Mikrobiomdatenbank erstellt, die als Referenzbibliothek für die Untersuchung von Proben mit anderen schwangerschaftsbedingten oder pathologischen Erkrankungen dienen kann.

Es wurde eine prospektive Studie an Lebendgeburten durchgeführt, die zwischen März 2020 und Januar 2021 zur Welt kamen. Es wurden Proben von Frauen, die im Bundang Hospital der Seoul National University entbunden hatten, und ihren Neugeborenen entnommen. Frauen mit instabilen Vitalfunktionen oder solche, die eine dringende Behandlung wie Transfusionen und Neugeborene benötigen, die auf der neonatologischen Intensivstation aufgenommen wurden oder die nach der Geburt instabile Vitalfunktionen hatten, wurden von der Studie ausgeschlossen. Zu den Proben für die Mikrobiomanalyse gehörten mütterliches VD, AF, CB, neonatale GL und M. Da eine schwangere Frau mit der Erwartung einer Entbindung ins Krankenhaus eingeliefert wurde, wurde die VD-Probe mithilfe eines Polyestertupfers entnommen, der in den hinteren Fornix der Vagina eingeführt wurde, unterstützt von sterilem Spekulumuntersuchung. Für diejenigen, die sich einem Kaiserschnitt zur Entbindung oder einer Amniozentese aus bestimmten Indikationen (z. B. zum Nachweis einer intraamniotischen Entzündung/Infektion) unterzogen hatten, wurden für die Studie etwa 10 ml Vorhofflimmern über eine Spritze entnommen. Während der Entbindung, sowohl per Kaiserschnitt als auch vaginal, wurden unmittelbar nach dem Abklemmen etwa 20 ml CB durch eine Spritze aus der Nabelschnurvene entnommen. Die Spritzennadel wurde an der Entbindungsstelle direkt in die Nabelschnur eingeführt und von sterilen Tüchern umgeben, um eine Kontamination des Operationsfeldes zu minimieren. Da das Entfernen von Fruchtwasser oder anderen Flüssigkeiten aus Mund und Magen des Neugeborenen nach der Geburt Teil der Erstbehandlung ist, um die Atemwege zu entlasten und die Spontanatmung zu stimulieren, erhielten die meisten Neugeborenen Absaugungen und die in der Saugflasche gesammelte Flüssigkeit (ca. 15 ml) wurde zur GL-Analyse in ein konisches Röhrchen überführt. Die M-Probe, der sehr frühe Stuhlgang des Neugeborenen, wurde sorgfältig innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt mit einem in den Anus eingeführten Polyestertupfer entnommen, während sich das Neugeborene nach der ersten Behandlung stabilisierte. Wir haben versucht, alle fünf verschiedenen Proben von jeder Frau und jedem Neugeborenen zu sammeln. Dennoch wurde ein kleiner Teil der Proben von Mutter-Neugeborenen-Paaren aus klinischen Gründen nicht entnommen oder übersehen. Das primäre Ergebnis war die Verteilung und Zusammensetzung des Mikrobioms der oben genannten Proben von schwangeren Frauen und ihren Neugeborenen. Um den Zusammenhang zwischen dem Mikrobiom verschiedener Kompartimente und geburtshilflichen Faktoren zu bestimmen, wurden medizinische Unterlagen gesammelt und gründlich überprüft. Zu den Daten gehörten das mütterliche Alter, das Gestationsalter bei der Entbindung, der Entbindungsmodus (vaginale Entbindung oder Kaiserschnitt), die Verwendung von ART, andere geburtshilfliche Komplikationen und neonatale Ergebnisse wie Geschlecht und Geburtsgewicht.

Diese Studie wurde mit der informierten Zustimmung der entsprechenden Teilnehmer in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Review Board des Seoul National University Bundang Hospital (B-1606/350-003) genehmigt.

Mikrobielle Desoxyribonukleinsäure (DNA) wurde aus den VD-, GL-, AF- und CB-Proben mit dem ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit (Zymo Research, Irvine, CA) und der Probe M mit dem DNeasy PowerSoil Pro Kit (Qiagen, Germantown, MD) extrahiert. nach Herstellerangaben. Kurz gesagt, die Proben wurden durch Schlagen der Perlen enzymatisch und mechanisch lysiert, gefolgt von Waschen und Filtern in der bereitgestellten Säule. Die extrahierten DNA-Konzentrationen wurden mit einem Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemessen. Die Gesamtmengen der extrahierten DNA wurden je nach Probentyp variiert, z. B. 1–10 ug für VD, 3 μg für CB, 30–200 ng für M und 50 ng für GL und AF. Für jede verwendete Box des DNA-Extraktionskits wurde kein Material als Negativkontrolle verwendet. Die Rohlinge wurden im gesamten Protokoll verarbeitet und analysiert.

Das 16S-ribosomale Ribonukleinsäure (rRNA)-Gen wurde unter Verwendung des zweistufigen Polymerasekettenreaktionsprotokolls (PCR) in der 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Illumina, San Diego, CA) amplifiziert. Im ersten PCR-Schritt wurde die hypervariable Region V3–V4 des 16S-rRNA-Gens unter Verwendung von 10 ng jeder Probe, 10 µM 341F/785R-Primern und Herculase II-Fusions-DNA-Polymerase (Agilent, Santa Clara, CA) amplifiziert. In der folgenden Primersequenz wird die Base „N“ aus einer beliebigen zufälligen Base ausgewählt, die Base „W“ ist A oder T, die Base „H“ ist A, C oder T und die Base „V“ ist A, C oder G.

341F: 5′- TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′

785R: 5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′

Der PCR-Zyklus wurde mit einem ersten Zyklus bei 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 25 Zyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, 55 °C für 30 Sekunden, 72 °C für 30 Sekunden und einem letzten Verlängerungszyklus bei 72 °C durchgeführt C für 5 Min. Die Amplikons wurden mit AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) gereinigt. In der zweiten PCR wurden Indexprimer aus dem Nextera DNA CD Index Kit (Illumina, San Diego, CA) an die Enden der in der ersten PCR erzeugten Amplifikate hinzugefügt. Der PCR-Zyklus wurde mit einem ersten Zyklus bei 95 °C für 3 Minuten durchgeführt, gefolgt von zehn Zyklen mit 95 °C für 30 Sekunden, 55 °C für 30 Sekunden, 72 °C für 30 Sekunden und einem letzten Verlängerungszyklus bei 72 °C C für 5 Min. Jede Probe wurde mit AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) gereinigt und in UltraPure DNase/RNase-Free Water (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) eluiert. Die amplifizierte DNA wurde mit einem 2100 Bioanalyzer-System unter Verwendung eines Agilent DNA 1000 Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) überprüft. Für jede Bibliotheksproduktion wurde keine Vorlage als Negativkontrolle verwendet.

Basierend auf der DNA-Größe und -Konzentration wurden die Amplikons in äquimolaren Mengen gepoolt und mit 30 % PhiX (Illumina, San Diego, CA) versetzt. Diese wurden dann auf der Illumina MiSeq-Plattform unter Verwendung des Paired-End-250-Zyklen-MiSeq-Reagenzienkits V2 (Illumina, San Diego, CA) und eines 300-Zyklen-MiSeq-Reagenzienkits V3 (Illumina, San Diego, CA) sequenziert. Negativkontrollen aus der DNA-Extraktion und -Bibliothek wurden sequenziert.

Wir haben die Proben in neun Chargen aufgeteilt (Läufe 1–9) und die V3-V4-Region des 16S-rRNA-Gens mithilfe von Illumina MiSeq-Geräten mit einer Zieltiefe von 100.000 pro Probe sequenziert (ergänzende Abbildung S8). Die Sequenzierung wurde für alle Sequenzierungsläufe mit 250-bp-Paired-End-Reads durchgeführt, mit Ausnahme des letzten (Lauf 9), bei dem aus praktischen Gründen die Sequenzierung mit 300-bp-Paired-End-Reads durchgeführt wurde. Die Lesequalitätswerte für jeden Sequenzierungslauf sind in der ergänzenden Abbildung S9 dargestellt. Das bcf2fastq-Programm von Illumina wurde verwendet, um Rohsequenzierungsdaten (BCL-Dateien) zu demultiplexen und Vorwärts- und Rückwärts-FASTQ-Dateien für jede Probe auszugeben. Bemerkenswert ist, dass einige Proben mehr als einmal sequenziert wurden, um die Auswirkungen von Chargeneffekten zu bewerten. Dazu gehörten „Sequenzierungsduplikate“, bei denen die identische NGS-Bibliothek einer Probe in separaten Läufen sequenziert wurde, und „Bibliotheksduplikate“, bei denen mehrere NGS-Bibliotheken zu unterschiedlichen Zeitpunkten aus derselben Probe erstellt und dann separat sequenziert wurden.

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Analysen mit der QIIME 2-Plattform durchgeführt, einer leistungsstarken, von der Community entwickelten Plattform für Mikrobiom-Bioinformatik34. Für jeden Sequenzierungslauf wurden FASTQ-Dateien in QIIME 2 und das DADA2-Plugin35 importiert, um ASVs zu identifizieren, indem Teile von Sequenzlesevorgängen mit geringer Qualität gekürzt, getrimmte Lesevorgänge entrauscht und anschließend die Vorwärts- und Rückwärtslesevorgänge zusammengeführt wurden (ergänzende Abbildung S8). Die beobachteten ASVs aus einzelnen Sequenzierungsläufen wurden dann in einer ASV-Tabelle zusammengeführt. Um potenzielle Kontaminanten zu erkennen und zu entfernen, führten wir das Decontam-Programm für unsere Proben durch, das nach ASVs pro Sequenzierungscharge suchte, die in Proben mit niedriger Konzentration häufiger auftraten und wiederholt in der Negativkontrolle gefunden wurden36. Die Taxonomieklassifizierung wurde mithilfe eines naiven Bayes-Klassifikators unter Verwendung der SILVA-Datenbank37 durchgeführt. Um die Ergebnisse von QIIME 2 zu visualisieren, haben wir das Dokdo-Programm (https://github.com/sbslee/dokdo) entwickelt, ein Open-Source- und MIT-lizenziertes Python-Paket für die Mikrobiom-Sequenzierungsanalyse mit QIIME 2. Dokdo verwendet die Anwendung intern Programmierschnittstelle von QIIME 2 und erfordert daher keine weiteren Abhängigkeiten. Dokdo kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Sekundäranalysen durchzuführen oder Zahlen in Publikationsqualität aus QIIME 2-Dateien/-Objekten zu erstellen (z. B. ein taxonomisches Balkendiagramm oder ein Alpha-Verdünnungsdiagramm).

Wir haben den QIIME 2-Befehl „qiime diversity core-metrics-phylogenetic“ verwendet, um die Alpha- und Beta-Diversitätsmetriken unserer Proben zu berechnen. Beim Ausführen des Befehls haben wir zur Normalisierung des Unterschieds in der Lesetiefe zwischen den Samples die Option „-p-sampling- Depth“ verwendet, um unsere Samples auf 5.000 Sequenzlesevorgänge zu verdünnen und eine gleiche Abdeckungstiefe zu erzielen. Wir stellten außerdem sicher, dass alle Proben bis zu einer ausreichenden Abdeckungstiefe für die Diversitätsanalyse sequenziert wurden, indem wir Verdünnungskurven erstellten (ergänzende Abbildung S10). Darüber hinaus haben wir die Option „-i-phylogeny“ verwendet, um einen verwurzelten phylogenetischen Baum der beobachteten ASVs bereitzustellen, der für die Durchführung von PCoA basierend auf der gewichteten UniFrac-Distanz38 erforderlich ist.

Um die unterschiedliche Häufigkeit des Mikrobioms im Kontext klinischer Informationen wie Frühgeburten zu bewerten, haben wir den QIIME 2-Befehl „qiime Composition Ancom“ verwendet, um ANCOM durchzuführen, das das zentrierte Log-Verhältnis (CLR) der relativen Häufigkeit zwischen zwei oder vergleicht weitere Probengruppen39. Um festzustellen, ob sich Probengruppen in der Beta-Diversität signifikant voneinander unterscheiden, haben wir PERMANOVA mit dem QIIME 2-Befehl „qiime Diversity Adonis“ durchgeführt, der lineare Modellannahmen an eine Distanzmatrix (z. B. gewichtetes UniFrac) mit den ausgewählten Variablen anpasst. Wir haben Bootstrapping-Hypothesetests durchgeführt, indem wir mit der Methode „scipy.stats.t.interval“ im scipy-Paket ein 95 %-Konfidenzintervall erstellt haben, um Ähnlichkeiten in der Mikrobiomzusammensetzung zwischen Zwillingen und zufällig ausgewählten Proben zu vergleichen40.

Die aus dieser Studie generierten Sequenzierungsdaten wurden über das European Nucleotide Archive (ENA) unter der Zugangsnummer PRJEB52455 in den INSDC-Datenbanken hinterlegt. Die ENA-URL lautet https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB52455. Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten Daten sind auf begründete schriftliche Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Fruchtwasser

Analyse der Zusammensetzung von Mikrobiomen

Assistierte Reproduktionstechnologie

Amplikon-Sequenzvarianten

Body-Mass-Index

Nabelschnurblut

Zentriertes Log-Verhältnis

Desoxyribonukleinsäure

Magenflüssigkeit

Intrauterine Insemination

In-vitro-Fertilisation und Embryotransfer

Mekonium

Nationales Zentrum für biotechnologische Informationen

Sequenzierung der nächsten Generation

Intensivstation für Neugeborene

Hauptkoordinatenanalyse

Polymerase Kettenreaktion

Permutationelle multivariate Varianzanalyse

Ribosomale Ribonukleinsäure

Zervikovaginaler Ausfluss

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Diese Studie wurde vom Bundang Hospital Research Fund der Seoul National University (14-2017-026) und dem World-class-300-Projekt des Ministeriums für KMU und Start-ups unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jee Yoon Park und Huiyoung Yun.

Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Republik Korea

Jee Yoon Park und Joong Shin Park

Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie, Seoul National University Bundang Hospital, Gyeonggi-do, Republik Korea

Jee Yoon Park & Hyeon Ji Kim

Abteilung für Pädiatrie, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Republik Korea

Der junge Hwa Jung und Chang Won Choi

Abteilung für Pädiatrie, Seoul National University Bundang Hospital, Gyeonggi-do, Republik Korea

Der junge Hwa Jung und Chang Won Choi

Precision Medicine Center, Seoul National University Bundang Hospital, Gyeonggi-do, Republik Korea

Huiyoung Yun, Seung-been Lee, Jong-Yeon Shin und Jeong-Sun Seo

Macrogen Inc, Seoul, Republik Korea

Huiyoung Yun, Seung-been Lee, Jong-Yeon Shin und Jeong-Sun Seo

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Das endgültige Manuskript wurde von allen Autoren eingesehen und genehmigt, und wir haben die gebotene Sorgfalt darauf verwendet, die Integrität der Arbeit wie folgt sicherzustellen: Garant für die Integrität der gesamten Studie: JYP, HY, JSP, JS; Studienkonzepte/Studiendesign: JYP, HY, SLHJK; Datenerfassung oder Datenanalyse/-interpretation: JYP, HY, YHJ, CWC, JS; Manuskriptentwurf oder Manuskriptrevision für wichtige intellektuelle Inhalte: JYP, HY, JS, JSP, JS; Genehmigung der endgültigen Version des eingereichten Manuskripts: JYP, HY, JSP, JS; erklären sich damit einverstanden, für alle Aspekte der Arbeit verantwortlich zu sein und sicherzustellen, dass Fragen im Zusammenhang mit der Genauigkeit oder Integrität eines Teils der Arbeit angemessen untersucht und gelöst werden; JYP, HY, SLHJK, YHJ, CWC, JS; Literaturrecherche: JYP, HY, SLHJK; statistische Analyse; JYP, HY, JS; Manuskriptbearbeitung: JYP, HY, JSP, JS

Korrespondenz mit Joong Shin Park oder Jeong-Sun Seo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Park, JY, Yun, H., Lee, Sb. et al. Eine umfassende Charakterisierung des mütterlichen, fetalen und neonatalen Mikrobioms unterstützt die pränatale Besiedlung des Magen-Darm-Trakts. Sci Rep 13, 4652 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31049-1

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Eingegangen: 22. April 2022

Angenommen: 06. März 2023

Veröffentlicht: 21. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31049-1

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